Análise de perfil imunológico

April 6, 2020

 

TECNOLOGIA DE PONTA A SERVIÇO DA VIDA, NO COMBATE AO COVID-19

 

Uma das vertentes de estudo do SARS-CoV-2 é entender como está o perfil imunológico de pacientes antes, durante e depois da infecção e possíveis tratamentos. Para isso, ferramentas que permitem obter o máximo de informações imunológicas de cada indivíduo são fundamentais. O sistema imunológico, como um todo, é um sistema difuso e composto por uma variedade extensa de células e caracterizá-las, com relação ao seu estado de maturação, expressão gênica e função, é de extrema importância e demanda tempo e um grande número de marcadores para análises. Já imaginou fazer uma análise proteômica de milhares de células isoladas?

 

A tecnologia Cytof de citometria de massas é o melhor caminho para alcançar esses resultados. Os equipamentos da Fluidigm, Helios e Hyperion, permitem a caracterização individual de células, no conceito single cell, acessando informações para identificação e caracterização de fenótipo, estado e função celular, em milhares de células ao mesmo tempo.

 

 

Mas o que é a tecnologia CyTOF?

É uma tecnologia inovadora que combina o sistema e fluxo de trabalho da citometria de fluxo para ordenar e separar células com a capacidade de definição da espectrometria de massas, capaz de identificar átomos e, portanto, múltiplos marcadores celulares individualmente e quantitativamente.

 

O sistema Helios

Tecnologia baseada nos imunoensaios clássicos, o Helios processa amostras marcadas com anticorpos conjugados a metais pesados, em um fluxo de trabalho semelhante ao fa citometria de fluxo fluorescente. Entretanto, Helios não tem as limitações encontradas nos ensaios com fluoróforos, como perda de fluorescência ou sobreposição espectral. Por se tratar de marcação estável com metal pesado, uma vez processada a amostra, a mesma pode ser armazenada por semanas antes da aquisição dos dados no equipamento, otimizando assim o fluxo de trabalho em qualquer tipo de laboratório.

 

Associado a isso, o Helios utiliza uma tecnologia de enfileiramento e empacotamento das células, e posterior ionização de cada célula com seu conteúdo de metais. Cada “nuvem” individual de metais, que corresponde a uma única célula, entra então na porção TOF (Time of Flight – espectrômetro de massa) do equipamento e cada íon é então identificado e quantificado, permitindo a análise qualitativa e quantitativa de cada analito-alvo.

 

E quantos analitos são possíveis?

Distribuídos entre 135 canais possíveis, hoje a Fluidigm oferece até 50 diferentes isótopos para marcação de suas proteínas de interesse, permitindo assim a análise conjunta de até 50 marcadores, sem sobreposição espectral. Isso significa que não existe a necessidade de controles internos de fluorescência ou de compensação espectral.

 

Figura 1 – Exemplificação de como se comportam os canais em um espectro de massa, para os metais pesados conjugados aos anticorpos na tecnologia de CyTOF.

 

 

Como Helios está ajudando no combate ao COVID-19?

O sistema de citometria de massas Helios está sendo usado para fazer o perfil imunológico de pacientes com pneumonia induzida por COVID-19 antes e depois do transplante de células-tronco mesenquimais (MSC). O estudo (Leng et al., 2020; DOI: 10.14336/AD.2020.0228) sugere que células-tronco mesenquimais podem curar ou melhorar significativamente a recuperação dos pacientes, sem efeitos adversos observáveis.

 

A intenção principal neste estudo é usar as propriedades imunomoduladoras das MSCs para reverter e prevenir o que estão chamando de “tempestade de citocinas” (cytokine storm), que seria o evento de maior agravamento da doença. Após o tratamento, foi observado aumento nos linfócitos periféricos enquanto as células imunocompetentes secretoras de citocinas superativadas, como células T CXCR3+CD4+, CXCR3+CD8+, e células NK CXCR3+ desapareceram em 3-6 dias. Adicionalmente, uma população de células dendríticas regulatórias CD14+CD11c+CD11bmid foi encontrada dramaticamente aumentada. Enquanto os níveis de TNF-α estavam significativamente reduzidos, e IL-10 aumentado no grupo tratado com MSC quando comparado com o grupo placebo.

 

Preocupada com essas evidências, a Fluidigm está oferecendo uma solução para caracterização do perfil imunológico de largo espectro, recentemente utilizado para entender como SARS-CoV-2 e suas versões mutantes se comportam em cada indivíduo. Com o Maxpar Direct Immune Profiling Assay™ e o software de análise Maxpar Pathsetter™ a Fluidigm oferece soluções para facilitar a análise e montagem de painéis exploratórios com os mais diversos marcadores. E ainda abrem o canal para possíveis customizações e desenvolvimento de novos produtos focados no novo coronavírus.

 

O esse ensaio, Maxpar Direct Immune Profiling Assay™, temos dados de imunofenotipagem abrangente de PBMC e sangue total humano, permitindo a identificação e enumeração simultânea de 37 subconjuntos de células imunocompetentes.

 

Figura 2 – Possíveis populações que podem ser verificadas com o painel Maxpar Direct Immune Profiling Assay™.

                 

 

O painel de anticorpos para 30 diferentes marcadores multiplexados e altamente otimizado foi desenvolvido com a participação de imunologistas especialistas na academia e na biofarma e baseia-se nos painéis projetados pelo Human ImmunoPhenotyping Consortium.

      

Projetado usando clones de anticorpos comprovados pela indústria, este ensaio fornece uma visão mais ampla do sistema imunológico em tubo único de cada amostra preciosa. Você não precisa mais comprometer o desenho do seu estudo devido às limitações da citometria por fluorescência.

 

 

Figura 3 – Marcadores fixos no painel Maxpar Direct Immune Profiling Assay™, e os canais livres que ainda podem ser preenchidos com outros marcadores de escolha do pesquisador.

 

 

A citometria de massa, com seu espectro de detecção baseado na massa do metal pesado conjugado, ao contrário de um espectro de fluorescência, o CyTOF apresenta sobreposição de canal limitada e uma ampla faixa de detecção, a expansão dos painéis de alto parâmetro é simplificada, permitindo uma vantagem significativa sobre a citometria de fluorescência.

 

O Maxpar Pathsetter é uma solução totalmente automatizada de análise de dados e relatórios que identifica automaticamente 37 tipos de células imunocompetentes em arquivos FCS a partir de amostras processadas com o ensaio de perfil de imunidade direta Maxpar.

 

Desenvolvido usando a modelagem de estado de probabilidade, uma abordagem analítica comprovada de alto parâmetro, o software elimina a variabilidade do gating manual e fornece uma solução eficiente e confiável para estudos longitudinais e multissite.

 

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10X Genomics Single Cell: Ampliando horizontes adicionando anticorpos de superfície da linha TotalSeq™ (Biolegend)

 

Estudos de single cell permitem focar nas informações do perfil transcricional célula-a-célula. A tecnologia da 10X Genomics utiliza o sistema Chromium em conjunto com a tecnologia NextGEM, possibilitando ensaios precisos a partir de centenas de micro-reações individuais de célula-a-célula.

 

Esferas em gel e amostras são então adicionadas a uma solução de óleo surfactante para criar Gel Beads in EMulsion (GEMs), que atuarão como vesículas de reação individuais. Cada esfera é recoberta por milhares de oligonucleitídeos (barcodes) que se ligam ao material genético de cada célula.

 

 

 

Figura 4 – Processo na geração de micro-reações individuais de células-a-células.

 

 

Os anticorpos oligo-conjugados da linha TotalSeq™, da Biolegend, permitem a identificação e quantificação de proteínas de superfície ou intracelulares de células isoladas, no conceito single cell. Além disso, a solução TotalSeq™ pode ser combinada no mesmo fluxo de trabalho de sequenciamento de RNA de Single Cell da 10x Genomics, usando as mesmas células. Assim, é possível obter simultaneamente dados proteômicos e transcriptômicos da mesma de milhares de células únicas.

 

 

Figura 5 – Ilustração descrevendo as possibilidades simultâneas de análise usando TotalSeq da Biolegend em conjunto com o Feature Barcoding da 10x Genomics.

 

 

Com a possibilidade de olhar para um grande número de células e saber o perfil de expressão gênica de cada célula da amostra, a Biolegend em parceria com a 10x Genomics, lançou a linha TotalSeq™ que possibilita identificar proteínas somadas ao transcriptoma.

 

São diversas as aplicações dadas ao uso dessa tecnologia. Com uma ampla variedade de alvos humanos disponíveis, você pode usar os anticorpos TotalSeq™ em várias áreas de pesquisa, incluindo:

 

- Medicina personalizada ou de precisão

- Pesquisa sobre câncer

- Investigação sobre células-tronco

- Imunologia Básica e Aplicada

- Descoberta de biomarcadores

- Caracterização de tipos de células novas ou raras

- Neuroimunologia

- Pesquisa de Vacinas

 

Contando com dezenas de anticorpos humanos validados para a técnica de TotalSeq, a parceria entre Biolegend e 10x Genomics permite o acesso à informação de cada população celular em nível single cell, e funciona de forma complementar aos dados gerados em uma citometria de alta dimensão como o Helios.

 Figura 6 – Cada ponto no gráfico determina uma célula. A imagem a esquerda mostra um gráfico de clusterização considerando a expressão gênica de cada célula. A direita, a clusterização da mesma amostra considerando o perfil de proteínas de superfície, possibilitando identificar os tipos celulares, além de criar uma comparação entre eles.

 

Cada possível população identificada pode ser marcada em alíquotas das mesmas amostras usadas no Helios com os anticorpos conjugados (com oligonucleotídeos) específicos para aquela população, e estas podem ter seu perfil de expressão gênica investigado por meio do Chromium 10x e posterior sequenciamento de nova geração, tudo isso com resolução célula-a-célula.

 

 

Figura 7 – Equipamento Chromium e cartucho para inserção das amostras e reagentes.

 

 

Como as tecnologias estão trabalhando no combate ao COVID-19?

 

Dentro do contexto da pandemia de COVID-19, a associação entre as tecnologias mencionadas de citometria de massas, CyTOF, os anticorpos oligo-conjugados TotalSeq da Biolegend e as aplicações single cell da 10X Genomics permitem que os cientistas do mundo todo busquem por populações específicas que indiquem evidências relevantes sobre o mecanismo de ação do SARS-CoV-2 e seu papel na imunização humana, com uma profundidade sem precedentes.

 

A compreensão profunda do perfil imunológico em doenças virais como COVID-19 permite que nos preparemos melhor contra futuros surtos, assim como identificar pessoas com maior propensão a apresentar agravamento de quadro clínico ou o exato oposto.

 

A Pensabio também está no combate à pandemia de Sars-CoV-2, e oferecemos as melhores soluções e tecnologias para a ciência nacional.

 

 

 

 

 

 

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