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Análise precisa e confiável de gDNA para Mapeamento Óptico

January 12, 2018

 

 

O mapeamento óptico do Saphyr ™ da Bionano Genomics® ajuda os pesquisadores a entender estruturas genômicas complexas que a técnica NGS não consegue resolver facilmente. Embora poderoso, o sucesso

de mapeamento óptico no Saphyr depende do uso de DNA genômico de alto peso molecular que atenda padrões de qualidade rigorosos. A análise de QC do DNA genômico é complexa e demorada. Usando o FEMTO Pulse® (Instrumento CE Automático de Campo Pulsado), a qualidade do DNA genômico pode ser avaliada com precisão e com uma escala de classificação desenvolvida para prever o desempenho de amostras no Saphyr.

Introdução:

O conjunto do genoma usando NGS geralmente é confundido por sequências de repetição e outras estruturas genômicas complexas, levando a incerteza na ordem, orientação e tamanho da fenda. Devido às limitações do NGS, muitas variações estruturais (SV) grandes (> 1 Kb) não são detectadas. Várias estratégias de sequenciamento e modelos computacionais foram desenvolvidos para tentar resolver esses problemas, mas continuam incapazes de resolver o genoma inteiro.

 

O mapeamento óptico complementa a montagem do genoma, fornecendo um molde, identificando e caracterizando SVs e rearranjos genômicos em todo o genoma. O Saphyr ™ da Bionano Genomics®, Inc. é o principal instrumento de mapeamento óptico no mercado. Para garantir um desempenho ideal no Saphyr, é recomendável uma análise de controle de qualidade robusta para garantir que somente amostras de DNA de alta qualidade sejam usadas. QC confiante de DNA genômico no FEMTO Pulse® da Advanced Analytical Technologies, Inc. antes do mapeamento óptico, fornece aos pesquisadores um método altamente preciso para garantir que cada projeto comece com o DNA de alta qualidade.

 

Saphyr™

O Saphyr é a plataforma de mapeamento óptico de terceira geração da Bionano Genomics para mapeamento de genoma de longo alcance rápido e de alto rendimento para construir mapas físicos de novo de quase qualquer genoma e fornecer capacidades incomparáveis ​​de descoberta de SV. O Saphyr e Saphyr Chip ™ combinam-se para entregar mapas do genoma na velocidade e escalas de suas demandas de pesquisa. As matrizes Bionano NanoChannel no Saphyr Chip mantêm as moléculas de DNA lineares e intactas, permitindo o mapeamento do genoma de longo alcance na resolução de uma única molécula.

Começando com a alta qualidade, o DNA de alto peso molecular é chave para o sucesso da plataforma. Moléculas de DNA longas (de 100 Kpb a Mpb) são marcadas com corante, depois rotulado usando uma variedade de enzimas que reconhecem 6 ou 7 bases. Moléculas únicas identificadas são varridas através dos arrays NanoChannel no Saphyr Chips e imagens são tiradas dessas moléculas. Os dados da imagem são digitalizados e as moléculas são alinhadas entre si para gerar uma montagem de novo usando o software da Bionano. A nova montagem pode ser usada para detectar SVs contra um genoma de referência (ou 2ª montagem de Bionano) ou usado como molde em um projeto de melhoria do genoma.

• Menos de 100ng de DNA marcados serão carregados em uma célula de fluxo

• Produção garantida de 640Gb por Saphyr Chip por dia para amostras humanas (320 Gb por célula de fluxo de moléculas maiores que 150 Kb)

• Apenas 5 dias de trabalho para ter o mapeamento completo da amostra

 

FEMTO Pulse®

O único instrumento de eletroforese capilar paralelo no mercado com uma fonte de energia de campo pulsado, o FEMTO Pulse fornece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para a análise de DNA genômico e grandes fragmentos de DNA. A análise do controle de qualidade (GDNA) e os grandes fragmentos de DNA são essenciais - incluindo quantificação, dimensionamento e qualificação - e nunca foi tão fácil ou mais rápido. Em contraste com a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), o FEMTO Pulse - usando eletroforese capilar de campo pulsado (PFCE) - completa o gDNA e grandes separações de fragmentos de DNA em aproximadamente uma hora, eliminando o PFGE durante a noite. Conduzido em paralelo, o FEMTO Pulse pode completar 12 separações por vez, sem comprometer a resolução ou a quantificação.

 

Métodos:

Preparação Inicial de Amostras

Bionano Genomics, Inc. forneceu 25 amostras de DNA genômico (gDNA) (Tabela 1) para análises de QC no FEMTO Pulse (Advanced Analytical Technologies, Ankeny, IA) para Advanced Analytical Technologies, Inc. As amostras foram diluídas para 200 pg / μL - 500 pg / μL no tampão de diluição 0,25X TE (DNF-497, Advanced Analytical Technologies, Ankeny, IA), exceto para amostras 16-19 que foram diluídas em água.

 

Separação no FEMTO Pulse

As amostras foram preparadas para PFCE no pulso FEMTO usando o gDNA Kit de análise de gDNA de 165 Kb (FP-1002, Advanced Analytical Technologies, Inc.). As amostras foram separadas no pulso FEMTO usando o método gDNA 165 Kb com PFCE de 70 minutos.

 

Análise de esfregaço A função de análise de esfregaço no software de análise de dados PROSize® (Advanced Analytical Technologies, Ankeny, IA) foi utilizada para quantificar e dimensionar os esfregaços de gDNA.

 

Genomic Quality Number (GQN) A pontuação de amostra com o GQN em PROSize foi utilizada para determinar a adequação de amostras de gDNA para uso no Saphyr. Foi empregado um GQN com limite de tamanho padronizado de 50,000 bp (GQN50Kb) e todos os fragmentos <20 000 pb foram excluídos da análise. Uma das três notas foi atribuída às amostras conforme determinado por GQNs: Fail (GQN50Kb <3.5), Equivocal (GQN50Kb = 3.5 - 4.5) ou Pass (GQN50Kb> 4.5).

 

Resultados:

O FEMTO Pulse forneceu análise de controle de qualidade superior de amostras de DNA genômico antes da análise no Saphyr; Previsão precisa de quais amostras são mais adequadas para o mapeamento óptico. Cada amostra recebeu uma das três notas possíveis: Fail (GQN50Kb <3.5), Equivocal (GQN50Kb = 3.5 - 4.5) ou Pass (GQN50Kb> 4.5). Essas notas refletem a qualidade do gDNA de alto peso molecular necessário para o mapeamento óptico bem sucedido no Saphyr.

 

A Bionano Genomics forneceu 25 amostras para análise no FEMTO Pulse que também foram executadas no Saphyr. Das 25 amostras fornecidas, o FEMTO Pulse previu com precisão o desempenho de 21 amostras no Saphyr (Tabela 1). Três das amostras fornecidas foram classificadas como Equivocal pelo FEMTO Pulse, as três passaram a funcionar bem no Saphyr. Uma única amostra não corresponde ao desempenho previsto no Saphyr. A amostra # 5 mostrou uma alta quantidade de degradação com baixos níveis de gDNA de alto peso molecular, recebendo um grau de falha no pulso FEMTO, embora o mapeamento óptico tenha sido bem sucedido no Saphyr.

 

Tabela:

Tabela 1. Resumo das amostras analisadas, incluindo o desempenho da amostra no FEMTO Pulse® e no Saphyr ™. As amostras destacadas em laranja são fornecidas como exemplos representativos nesta seção. As amostras marcadas com * tiveram uma n = 2. ** O tamanho esperado foi determinado através de uma combinação de eletroforese em gel de campo pulsado e o N50 gerado por corrida Saphyr.

 

Classificação: Fail

Amostras que recebem um ranking de Fail são caracterizadas por degradação extensiva e fragmentação de DNA genômico de alto peso molecular (Figura 1). As amostras de DNA genômico que falham na análise de QC no FEMTO Pulse não são adequadas para análises futuras no Saphyr. Essas amostras não possuem a quantidade necessária de DNA de alto peso molecular para o sucesso do mapeamento óptico.

 

Figura 1. Separação do DNA genômico de plantas extraído no FEMTO Pulse® usando o kit de Análise FPD-1002 gDNA 165 Kb. A análise pós-separação foi realizada usando PROSize® Data Analysis Software. A amostra apresentou degradação e fragmentação extensiva, formando um esfregaço com um tamanho médio de 49.972 pb, conforme determinado pela análise de esfregaço (Faixa: 1 Kb - 650 Kb, n = 3). Com um GQN50Kb de 2,8, esta amostra não atendia aos critérios necessários para uso no Saphyr ™.

 

Classificação: Equivocal

As amostras que recebem uma classificação Equivocal apresentam quantidades moderadas de degradação e baixas quantidades de DNA de peso molecular mais elevado, adequado para o mapeamento óptico (Figura 2). Maiores quantidades de DNA degradado podem confundir a análise de QC. Embora essas amostras possam revelar-se de qualidade suficiente para o mapeamento óptico, seu desempenho no Saphyr não pode ser previsto.

 

Figura 2. Separação do DNA genômico humano extraído no FEMTO Pulse® usando o kit de análise de gDNA FP-1002 165 Kb. A análise pós-separação foi realizada usando PROSize® Data Analysis Software. A amostra apresentou degradação e fragmentação moderadas, formando um esfregaço com um tamanho médio de 46.287 pb, conforme determinado pela análise de esfregaço (intervalo, 1.2 Kb - 650 Kb, n = 3). Com um GQN50Kb de 4.0, a amostra recebe um grau de Equivocal.

 

Classificação: Pass

As amostras que recebem uma classificação em Pass diferem-se com baixos níveis de degradação e são caracterizadas pela presença de uma quantidade significativa de DNA de alto peso molecular (Figura 3). As amostras que atendem a esses critérios são ideais para o mapeamento óptico no Saphyr.

 

Figura 3. Separações do DNA genômico de animais extraídos realizados no FEMTO Pulse® usando o kit de análise de gDNA FP-1002 165 Kb. A análise pós-separação foi realizada usando PROSize® Data Analysis Software. A) ADN genômico cervical. Tamanho médio do esfregaço de 136.192 pb, conforme determinado pela análise de esfregaço (Faixa: 1 Kb - 650 Kb, n = 3). Com um GQN50Kb de 7.0, esta amostra atende aos critérios de análise confiável no Saphyr ™. B) DNA genômico de rã. Tamanho médio do esfregaço de 173.468 pb, conforme determinado pela Análise de esfregaço (Faixa: 1.2 Kb - 650 Kb, n = 3). Com um GQN50Kb de 9,4, esta amostra excede os critérios para uma análise precisa do Saphyr ™

 

Resumo

O Saphyr fornece mapeamento óptico de diversos tipos de amostra, ajudando a esclarecer a estrutura do genoma oculta nas estratégias de NGS. O uso de DNA de alto peso molecular de alta qualidade é essencial para o sucesso do mapeamento óptico. O FEMTO Pulse fornece análises QC de DNA de alto peso molecular incomparáveis com outras técnicas. Usando a eletroforese capilar de campo pulsado, o FEMTO Pulse executa a separações de fragmentos de DNA de até 165 Kb em aproximadamente uma hora. A análise subjetiva da qualidade da amostra é eliminada com o Genomic Quality Number (GQN). Usando um padrão de tamanho, o FEMTO Pulse pode determinar com precisão se uma amostra pode ser executada com sucesso no Saphyr.

 

 

 

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